Modélisation en enzymologie sous Régressi

(Protocole et résultats tirés  des TP de l'Agrégation interne de BGB session 2001)

M. CAVALLA 05/2003

 

 

Voici un protocole et les résultats correspondants à l'inhibition de l'activité enzymatique de l'invertase par excès de substrat (saccharose). Cette hydrolase catalyse l'hydrolyse du saccharose en glucose et fructose selon l'équation :

Saccharose + Eau à glucose + fructose

 

 

 

Mesure de la vitesse d'hydrolyse du saccharose à 30°C

Dans un tube à essais introduire :

Incuber 2 minutes

Prélever 1 mL de milieu réactionnel et transférer immédiatement dans un tube contenant 2 mL de réactif au 3.5 DNS.

Boucher au papier d'aluminium et porter au bain-marie bouillant 5 minutes exactement.

Résultats :

 

[S) mM

A530

0

0

20

0.522

40

0.862

80

1.260

100

1.370

200

1.433

400

1.500

600

1.410

1000

1.145

1500

0.802

Refroidir en plongeant le tube dans un bain de glace fondante et ajouter 10 mL d'eau distillée.

Attendre 10 minutes et lire l'absorbance à 530 nm.

Tester les concentrations suivantes dans le milieu réactionnel : 20 ; 40 ; 80 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ; 600 ; 1000 ; 1500 mmol/L.

 

Données : le KM de l'invertase est voisin de 50 mmol/L à pH 4.5.

 

 

Ces résultats peuvent être modélisés assez facilement sous Régressi afin de calculer les constantes Vmax, KM et la constante d'inhibition kss.

 

 

Dans un premier temps, déterminer KM et Vmax sur la zone de concentrations où l'inhibition par excès de substrat n'entre pas en jeu :

On définit deux variables : S pour la concentration en substrat (en abscisse) et A530 en ordonnée qui correspond à l'absorbance du produit formé en deux minutes dosé par le 3.5 DNS.

Ensuite, on définit invS=1/S et invV=1/A520. On représente invV=f(invS) et on modélise :

 

invV=(KM/Vmax)*invS+1/Vmax

 

Modélisation en doubles inverses (Lineweaver et Burk) entre 20-100 mM

 

On détermine : KM = 70.1 mM           Vmax = 2.36 uA/2 min

 

 

On repasse en représentation directe A530=f(S) et on modélise sur l'ensemble des points par :

 

A530=Vmax*S/(KM+S*(1+S/kss))

 

Remarque : on peut dans un premier temps remplacer KM et Vmax par leur valeur numérique déterminée précédemment (A530=2.36*S/(70.1+S*(1+S/kss))) et les remplacer ensuite par leur nom de variable afin d'ajuster le modèle

(A530=Vmax*S/(KM+S*(1+S/kss))).

 

Les valeurs calculées sont : KM = 69.2 mM                Vmax = 2.41 uA/2 min            Kss = 900 mM